重要器官傷口的大出血通常會導致嚴重失血，全球30%以上的人口死于意外事故和手術中的大出血。特別是穿透傷致死性主動脈破裂和無法控制的心臟大出血是急診搶救中的重要問題。出血控制非常具有時間敏感性，快速止血干預將決定受傷患者的生存。目前臨床手術中最常用的閉合傷口止血手段是外科紗布、縫線和縫合釘。然而，對于心臟、肝臟、脾臟等脆弱易出血器官，使用這些方法止血容易造成二次損傷，甚至導致手術失敗。

基于此，中國科學院化學研究所吳德成教授、中國人民解放軍總醫院唐佩福教授、張里程副教授和國家納米中心Feifei Sun合作開發了一種共價交聯的AG-PEG膠，基于細胞外基質樣的氨基明膠(AG)和PEG衍生物。AG-PEG膠水快速成膠，并在給藥后與各種潮濕組織表現出牢固和不分青紅皂白的緊密粘附。形成的膠水形成了一種粘稠而堅固的屏障，密封動脈、肝臟和心臟的出血性傷口，使其能夠承受高達380 mmHg的血壓，而正常收縮壓為60-180 mmHg。值得注意的是，在豬心臟直徑為6 mm的穿通孔中，使用膠水可以在60秒內有效地阻止大量出血。術后各指標逐漸恢復，14 d時心臟創面明顯再生。AG-PEG膠具有隨需溶解度、自膠性和快速降解性，可能為臨床止血和緊急搶救提供一種新穎的止血方法。相關工作以“A Super Tough, Rapidly Biodegradable Ultrafast Hemostatic Bioglue”發表在《 Advanced Materials》。

【文章要點】

圖1. AG-PEG膠的原理圖制作及力學強度研究

AG-PEG膠的合成及物理表征

以氨基明膠(AG)和四臂聚(乙二醇)琥珀酰亞胺琥珀酸鹽為原料，制備了一種可控制溶解、快速成膠的生物膠，具有堅韌的機械強度、快速生物降解和黏附性能。明膠的氨基部分在接觸后與PEG的琥珀酰亞胺活性酯快速反應，AG-PEG膠水在幾秒鐘內完全明膠化，從而有效地黏附和密封急性出血組織，快速止血(圖1A)。此外，部分琥珀酰亞胺活性酯部分立即與蛋白質的氨基發生相互作用，從而在水凝膠和組織之間牢固地形成化學結合。氨基的引入增加了交聯密度，從而允許AG與Tetra-PEG-SS混合，形成透明堅韌的水凝膠(原始明膠不能)。考察了前體溶液中不同濃度AG-PEG組分的AG-PEG膠的成膠時間。當濃度從5 wt%增加到30 wt%時，凝膠化時間從(80.1 ± 3.2)s減少到(37.0 ± 3.8)s，差異有統計學意義。這可能是由于前驅體溶液中交聯點濃度過高，加速了膠凝相變的發生。而極短的成膠時間(~ 8 s)導致形成糟糕的水凝膠，不均勻的交聯導致較弱的機械強度和較差的粘附性。稍微延長AG-PEG膠的成膠時間可有效促進膠的均一性。此外，我們改進了操作方式，通過連接器將兩個填充AG和Tetra-PEG-SS溶液的注射器來回推三次，使預膠溶液快速混合，預膠溶液注射到出血創面后立即膠凝，無需外部催化(圖1B)。

圖2. AG-PEG膠的體外粘接與密封研究

AG-PEG膠的粘接與密封研究

AG-PEG的粘附強度決定了其至關重要的止血性能，因為在血液流動的情況下，膠水需要快速粘附才能止血。能夠通過柔性網絡耗散能量的粘合劑必須與組織形成牢固的粘結。由于AG-PEG膠水上的琥珀酰亞胺-活性酯部分與組織的氨基之間有很強的化學鍵合，因此AG-PEG膠水不能被水沖走，這表明它對組織有很強的粘附性。它可以在水下注射，用于潛在的止血應用于介入手術。采用抗壓能力相關的爆破壓力試驗，評價膠粘劑能否形成牢固的密封性，以維持液體在動脈內的流動。圖2A顯示AG-PEG在濕豬腹主動脈上迅速形成并密封了直徑為2 mm的穿透孔。15秒后，將主動脈以1 cm/min的流速泵入流動的PBS溶液中，持續保持密封直至破裂，破裂壓力為~ 55 kPa (~ 376 mmHg)，顯著高于人類正常的動脈收縮壓(60 ~ 160 mmHg)和商用纖維蛋白膠(75±16 mmHg)(圖2B)。抗壓力性能優于文獻報道的水凝膠。

圖3. AG-PEG膠的生物相容性、凝血能力和生物降解性能

AG-PEG膠的生物相容性、凝血能力和生物降解性能

低細胞毒性和良好的血液相容性是應用水凝膠作為體內止血材料的重要先決條件。由于前體(PEG和明膠衍生物)具有固有的生物相容性本質，與NIH3T3細胞孵育5天后，研究者在CCK8細胞活力和活/死熒光測試中驗證了出色的細胞相容性。一種有效的密封材料必須在最大限度減少血細胞損傷的同時誘導立即有效的血液凝固。為了評估AG-PEG膠的凝血能力，研究者通過添加到密封膠涂層的96孔板來確定全血的凝血時間(圖3A)。在AG-PEG膠水或纖維蛋白膠水涂覆的孔中，血凝塊分別耗時7.5 min和6.5 min，遠快于未涂覆孔(對照)的12 min(圖3B)。AG-PEG凝膠優異的凝血能力可能是由于AG上大量帶正電荷的氨基成分與帶負電荷的血細胞和蛋白質發生離子相互作用，從而形成絮凝物，加速凝血過程。此外，作為蛋白質分離純化的常用聚合物，引入PEG衍生物的膠促進血液中的蛋白質絮凝，從而加速血液凝固。并對優化后的膠水配方進行血液相容性分析。如圖3C-D所示。與RBC上清液孵育12 h后，AG-PEG膠的溶血率約為3.8%，低于醫用材料國際標準的5%，表明AG-PEG膠具有理想的血液相容性。

圖4. 大鼠肝損傷模型的止血與愈合

大鼠肝損傷的止血與愈合

通過大鼠出血性肝損傷模型初步研究了AG-PEG膠的體內止血能力。將手術刀切割的創面(長10 mm ×深3 mm)制成出血創面，AG-PEG膠注射后即可立即封閉出血創面，而紗布治療組和纖維蛋白膠組均導致創面大量出血(圖4A)，但纖維蛋白膠最終止血。記錄肝臟止血過程中出血量和止血時間，定量評估活體止血能力。經紗布、纖維蛋白膠和AG-PEG膠處理后，出血可在6 min、100 s和20 s內停止，相應的出血量分別為400 mg、300 mg和50 mg(圖4B-E)。與紗布治療相比，使用AG-PEG膠的止血時間和出血量顯著減少94%和87%(圖4D-E)。更重要的是，與紗布輔助外壓治療不同，AG-PEG膠無需輔助即可自膠化，更適合治療不可壓性腔內出血。對紗布和膠粘處理后的肝損傷部位進行拍照和組織學觀察，觀察大鼠安樂死后的愈合時間。在術后第7天，紗布治療組出現了嚴重的術后粘連(圖4C)， 28天后，盡管部分組織再生，但仍可見微小的切口。相比之下，經過膠水處理的切口顯示出快速愈合和再生，膠水在14天內繼續降解和代謝，這與肝臟上Cy5.5 NHS酯標記的體內成像一致(圖3F)。同時，切口變得可忽略不計，無炎癥反應，有新生肝細胞存在。28 d后，肝創面再生良好，組織完整(圖4F-G)。綜上所述，AG-PEG膠優異的封閉性能歸因于其止血及時、降解快，促進創面再生，使其能夠起到粘連和物理屏障的作用，成為高效的止血封閉劑。

圖5. 兔股動脈大出血、肝、心損傷模型的止血

家兔大出血的止血與封閉

研究者分別構建了雌性新西蘭兔(2~3月齡，3.0~3.5 kg)的體內動脈、肝臟和心臟出血模型，以進一步證實AG-PEG膠在更有臨床意義的情況下的體內療效(圖6A)。在外科手術中，通過動脈(0.8 mm Φ)、心臟穿刺(1.2 mm Φ)、左肝葉切肝(長30 mm ×深5 mm，左肝葉)，兔出現出血，尤其是從動脈和心臟創面噴出血液(圖5B-D)。治療組采用AG-PEG膠進行止血治療，比較兩組出血量和止血時間，并與商品纖維蛋白膠和紗布進行對照。注入AG-PEG膠后，在不借助止血鉗的情況下，15 s內即可完全成功止血穿刺極部動脈，出血量約1 g(圖5E)。相比之下，使用纖維蛋白膠直到止血鉗夾住動脈才能止血，更嚴重的是，在取出止血鉗后，血液繼續滲出，導致嚴重失血超過10 g(圖5E)。纖維蛋白膠可在350 s內止血，出血量超過2 g。采用AG-PEG膠處理切口時，出血量明顯減少至0.7 g，止血時間縮短至~ 10 s(圖5F)。值得注意的是，AG-PEG膠在穿刺創面注射20 s后能夠迅速有效地阻止兔心臟的大量出血，出血量極少，約1.6 g，密封后沒有進一步滲漏(圖5G)。

圖6. AG-PEG膠對豬股動脈大出血和肝損傷模型的止血作用

豬大出血的止血與封閉

在豬出血實驗手術中(3月齡巴馬豬，體重30~35 kg, n=3)，在豬股動脈中制造直徑1.2 mm ×深度1~ 2 mm的損傷，誘導動脈血從穿刺處排出。注射AG-PEG膠前，用止血鉗鉗夾動脈。15秒后，讓AG和PEG在動脈上有足夠的相互作用，取出止血鉗，從穿刺處沒有看到進一步的出血(圖6A-B)。而在應用纖維蛋白膠后，可以看到血液在松弛止血鉗后立即流出。手術結果生動地證明了AG-PEG膠的快速止血能力。同樣，AG-PEG膠對豬的出血性肝損傷也有快速止血的效果(圖6C)。研究者在豬脾上創建了直徑30 mm、深度5 mm的切口，豬脾通常是一個脆弱的內臟器官，切口有大量出血。應用AG-PEG膠后止血。對安樂死后的1頭豬進行術后肝、脾組織分析。病理切片染色顯示，膠水有效封閉了創面，創面界面幾乎沒有壞死，也很少出現炎癥(圖6D-E)，證明AG-PEG膠水具有良好的生物相容性和柔性黏附。此外，良好的血液相容性和黏附性刺激大量的紅細胞和血小板黏附在膠水上，加速血液凝固(圖6F-G)。

【小結】

在這項工作中，研究者報道了一種基于明膠和PEG的可注射的快速原位交聯水凝膠作為急診治療的組織封閉劑，克服了傳統封閉劑不能阻止大量組織出血的缺點。富含氨基的明膠增加了交聯密度，形成了具有更高黏聚強度的AG-PEG，表現出更強的機械和黏附性能，同時保留了按需溶解的特性。冷水魚皮明膠的良好流動性有助于更好的組織適用性，對出血創面形成強大的物理屏障。由于其較強的力學性能，可以通過簡單的調整成分含量來控制凝膠時間，從而定制化滿足不同出血組織的止血需求。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202208622

來源：BioMed科技